Mario Del Monaco nació en Florencia en una familia de clase alta musical. De niño estudió violín, pero tenía pasión por el canto. Se graduó en el Conservatorio Rossini de Pesaro, donde conoció y cantó por primera vez con Renata Tebaldi, con quien formaría una especie de dúo operístico de ensueño en la década de 1950. Entre sus primeros mentores como cantante se encontraban Arturo Melocchi, su profesor en Pesaro, y el Maestro Raffaelli, quien reconoció su talento y ayudó a lanzar su carrera.Esa carrera comenzó en serio con el debut de Del Monaco el 31 de diciembre de 1940, como Pinkerton en el Teatro Puccini de Milán. (Su primera aparición en una ópera había tenido lugar el año anterior, sin embargo, en Cavalleria rusticana de Mascagni en Pesaro.) Cantó en Italia durante la Segunda Guerra Mundial y se casó, en 1941, con Rina Filipini. En 1946, apareció en la Royal Opera House de Londres, Covent Garden, por primera vez. Durante los años siguientes se hizo famoso no sólo en Londres sino también en todo el mundo operístico por su voz potente y metálica. Era casi como una heldentenor en alcance, pero Del Monaco no era wagneriano, limitando sus actividades abrumadoramente al repertorio italiano.
Mario Del Monaco cantó en la Ópera Metropolitana de Nueva York de 1951 a 1959, y disfrutó de un éxito especial en papeles dramáticos de Verdi, como Radamés. Pronto se estableció como uno de los cuatro tenores italianos superestrellas que alcanzaron la cima de su fama en los años 50 y 60, junto con Giuseppe Di Stefano, Carlo Bergonzi y Franco Corelli. Se podría argumentar que se trataba de un grupo de superestrellas. Los papeles emblemáticos de Del Monaco durante este período fueron Andrea Chénier de Giordano y Otello de Verdi.
Del Monaco interpretó Otello por primera vez en 1950 y fue perfeccionando su interpretación a lo largo de su carrera. Se dice que cantó Otello la asombrosa cantidad de 427 veces. Sin embargo, el libro publicado por Elisabetta Romagnolo, Mario Del Monaco, Monumentum aere perennius, Azzali 2002, enumera solo 218 apariciones suyas como Otello, que es una cifra más realista. Acertadamente, el tenor fue enterrado con su traje de Otello. Aunque Otello fue su mejor papel, a lo largo de su carrera, Del Monaco cantó otros papeles con gran éxito, por ejemplo: Canio en Pagliacci (Leoncavallo), Radamés en Aida (Verdi), Don José en Carmen (Bizet), Chenier en Andrea Chénier (Giordano), Manrico en Il trovatore (Verdi), Sansón en Sansón y Dalila (Saint-Saëns) y Don Álvaro en La forza del destino (Verdi).
Mario Del Monaco realizó sus primeras grabaciones en Milán en 1948 para HMV. Más tarde, Renata Tebaldi lo acompañó en una larga serie de óperas de Verdi y Puccini grabadas para Decca. En el mismo sello se grabó en 1969 Fedora de Giordano, junto a Magda Olivero y Tito Gobbi.
En 1975 se retiró de los escenarios. Murió en Mestre a consecuencia de una nefritis.
Mario Del Monaco perteneció a un linaje alguna vez floreciente de tenores dramáticos nacidos en Italia. Entre sus predecesores famosos se encuentran Francesco Tamagno, Francesco Signorini, Giuseppe Borgatti, Giovanni Zenatello, Edoardo Ferrari-Fontana, Bernardo de Muro, Giovanni Martinelli, Aureliano Pertile y Francesco Merli, entre otros.
Su sobrina Donella Del Monaco, soprano, es la cantante del Opus Avantra.